ConstructionofanovelEscherichiacoliexpressionsystem:relocationoflpxAfromchromosometoaconstitutiveexpressionvector
文章来源：本文是由LeiZhao、XiaoqingHu等人于年7月在《AppliedMicrobiologyandBiotechnology》（IF=3.92，二区）上发表
研究背景
为了在大肠杆菌中筛选和维持重组质粒，常用的标记物是抗生素耐药基因。然而，抗生素耐药基因的水平转移会导致多重耐药生物的出现。因此，在不添加抗生素的情况下维持质粒的几种方法已经被开发出来。第一个例子是FabV-三氯生系统，其中三氯生用于维持质粒，但它可能有助于抗生素耐药性。第二个例子是以*素/抗*素为基础的系统，该系统中的质粒由*素和抗*素之间的平衡来维持，它们分别在基因组和质粒中表达，但是，在长期的培养过程中，这个系统是无效的。第三个例子是一种基于无抗生素RNA的方法，它使用sacB的组成性表达作为一个反选择标记，但是在细胞生长过程中必须添加蔗糖，这不适合工业发酵，因为发酵培养基通常含有蔗糖。图1a大肠杆菌中脂多糖的生物合成；由lpxA编码的LpxA催化该途径的第一个反应，对大肠杆菌的生长至关重要。b基因lpxA与其他基因lpxB、lpxD和fabZ位于相同的操纵子内。lpxA和lpxB的开放阅读框有一定的重叠，lpxA中包含了lpxB的翻译信号，同样，lpxA的翻译信号也包含在其上游基因fadZ中，删除lpxA后，fadZ就在lpxB的上游，lpxB可以使用fadZ中包含的翻译信号
另一种避免抗生素添加的方法是从染色体上移除一个必需基因并将其包含在质粒中。必需基因lpxA编码UDP-N-乙酰氨基葡萄糖乙酰转移酶，催化脂质A生物合成途径中的第一反应，与lpxB、lpxD和fabZ位于同一个操纵子上（如图1所示）。一般来说，LpxA是细胞分裂和生存所必需的，过表达lpxA对细胞生长没有影响。本研究开发了含有lpxA载体的大肠杆菌lpxA缺失突变体，并利用该突变体系统提高了大肠杆菌L-苏氨酸的产量。
文章摘要
基于质粒的表达系统中的选择性标记通常是编码抗生素耐药蛋白的基因，因此，在培养细菌时必须加入抗生素以保证质粒不丢失。但抗生素的添加会导致生产成本的增加和环境的污染。本研究开发了一种新型大肠杆菌表达系统，即含有lpxA载体的lpxA缺失突变体。为了开发该系统，构建了三个质粒pCas9Cre、pTF-A-UD和pRSFCmlpxA。质粒pCas9Cre可在42℃条件下产生Cas9、λ-Red和Cre三种酶；pTF-A-UD含有几个可以删除染色体lpxA的DNA片段，可以通过添加IPTG进行诱导；pRSFCmlpxA含有lpxA突变体lpxA和CamR。利用这三种质粒对大肠杆菌进行转化后，可以有效去除染色体lpxA和pRSFCmlpxA中的CamR，从而产生含有pRSFlpxA的大肠杆菌lpxA突变体。lpxA是大肠杆菌生长所必需的，它从染色体上转移到组成性表达载体是不通过添加抗生素来维持载体的理想策略。pRSFlpxA中的lpxA可以补充染色体lpxA的缺失，为质粒pRSFlpxA的维持提供强大的选择压力。这项研究证明了这种新的表达系统是方便有效的，可用于提高野生型大肠杆菌MG和L-苏氨酸产生菌大肠杆菌TWF中L-苏氨酸的生物合成。
实验结果与分析
1.在质粒中过表达lpxA突变体，同时敲除大肠杆菌MG中的染色体lpxA
由于CRISPR-Cas9系统具有较高的基因敲除效率，因此选择该系统去除大肠杆菌中必需的lpxA基因。由于lpxA是一种必需基因，在从染色体中去除之前，它必须在质粒中表达。为了避免CRISPR-Cas9系统编辑质粒中的lpxA，必须对质粒中lpxA的PAM序列进行突变，并且突变必须保持沉默，以维持LpxA的正确氨基酸。在lpxA的9个PAM候选中，选择了3个(靶1、靶2和靶3)。基于这三个PAM靶点，设计了三个sgRNA（sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3），并分析了它们的匹配效率分别为63%、71%和57%。构建了8个含有不同数量沉默突变的lpxA突变体（lpxA0、lpxA1、lpxA2、lpxA3、lpxA12、lpxA13、lpxA23和lpxA）。将8个lpxA突变体与相应的sgRNAs插入pTargetF中，得到质粒pTF-A0、pTF-A1、pTF-A2、pTF-A3、pTF-A12、pTF-A13、pTF-A23和pTF-A。将这些质粒分别转化到大肠杆菌MG/pCas9株中，在添加卡那霉素和奇霉素的LB平板上生长。结果表明，当使用pTF-A时，缺失率达到49.3%，说明三个靶点的9个沉默突变可以有效阻止Cas9的结合，可以得出染色体lpxA的缺失效率取决于PAM靶基因沉默突变的数量。由于使用pTF-A时获得了染色体lpxA的有效缺失，将lpxA-UD插入pTF-A中，去除lpxA，得到pTF-A-UD。图2本研究选择lpxA中三个靶点的序列作为Cas9的靶点。PAM和N20序列下划线。表中列出了不同质粒表达的lpxA中与这些靶点对应的沉默突变
表1不同lpxA突变体质粒的缺失效率的比较
2.基于lpxA染色体缺失的新型大肠杆菌表达系统的建立
该系统包含三个质粒:pCas9Cre、pTF-A-UD和pRSFCmlpxA。质粒pcas9cre含有一个热敏复制子repA（ts），一个由lacIq-Ptrc启动子控制的sgRNA-pMB1，它能引导Cas9与pTF-A-UD上的pMB1以及编码Cas9、λ-red和Cre酶的基因的结合。pTF-A-UD含有DNA片段lpxA-UD和sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3，可以引导Cas9结合染色体lpxA。pRSFCmlpxA包含lpxA和CamR，两侧分别有loxpLE和loxpRE。将这三个质粒转化至大肠杆菌MG;CRISPR-Cas9系统可以去除染色体lpxA基因。然后加入IPTG诱导pTF-A-UD，Cre去除pRSFCmlpxA中的CamR，42℃生长诱导pCas9Cre，得到MG△lpxA/pRSFlpxA。实验结果表明，该方法的敲除效率达到63.8%。MG△lpxA/pRSFlpxA和MG/pRSFCmlpxA在LB培养基中生长，在不同世代提取质粒并在琼脂糖凝胶上进行分离。在不含抗生素的LB培养基中生长时，质粒pRSFlpxA在MG△lpxA中至少能维持h，而pRSFCmlpxA在MG中只能维持h。这说明本研究开发的表达系统是一个无抗生素且稳定的表达系统。MG/pRSFCm、MG/pRSFCmlpxA、MG△lpxA/pRSFCmlpxA和MG△lpxA/pRSFlpxA细胞生长曲线相似。36h后，MG/pRSFCm、MG/pRSFCmlpxA、MG△lpxA/pRSFCmlpxA、MG△lpxA/pRSFlpxA的OD分别达到4.43、4.49、4.26、4.57。这表明lpxA在质粒中的过度表达或lpxA从染色体上转移到质粒上对大肠杆菌的生长没有显著影响。
图3本研究开发的表达系统。a三个质粒pCas9Cre、pRSFCmlpxA和pTF-A-UD的图谱。b表达系统在大肠杆菌中的应用示意图。c证明了表达质粒pRSFlpxA在MG△lpxA中的稳定性。dMG/pRSFCm、MG/pRSFCmlpxA、MG△lpxA/pRSFCmlpxA、MG△lpxA/pRSFlpxA细胞生长曲线比较
3.新型表达体系在大肠杆菌L-苏氨酸生产中的应用
在pRSFCm和pRSFCmlpxA中插入L-苏氨酸生物合成途径的关键基因thrA*(一种具有反馈抗性的突变体thrA)、thrB和thrC，以及用于L-苏氨酸输出的基因rhtA，分别得到质粒pRSFCm-thrA*BC-rhtA和pRSFCmlpxA-thrA*BC-rhtA。将这些质粒转化至大肠杆菌MG和TWF，分别得到MG/pRSFCm、MG/pRSFCmlpxA、MG/pRSFCm-thrA*BC-rhtA、MG/pRSFCmlpxA-thrA*BC-rhtA、TWF/pRSFCm、TWF/pRSFCmlpxA、TWF/pRSFCm-thrA*BC-rhtA和TWF/pRSFCmlpxA-thrA*BC-rhtA。将pRSFCmlpxA与pCas和pTF-A-UD一起转化至大肠杆菌MG和TWF，分别得到MG△lpxA/pRSFCmlpxA和TWF△lpxA/pRSFCmlpxA。将pRSFCmlpxA-thrA*BC-rhtA与pCas9Cre和pTF-A-UD一起转化至大肠杆菌MG和TWF，分别得到MG△lpxA/pRSFlpxA-thrA*BC-rhtA和TWF△lpxA/pRSFCmlpxA-thrA*BC-rhtA。结果表明，无论是lpxA在质粒中的过度表达，还是lpxA从染色体上转移到质粒上，都不会影响菌株的生长，同时还表明基因簇thrA*BC-rhtA的表达（而不是基因lpxA的表达），提高了重组大肠杆菌菌株L-苏氨酸的产量。图4L-苏氨酸合成表达体系的应用。a质粒pRSFCm、pRSFCm-thrA*BC-rhtA、pRSFCmlpxA-thrA*BC-rhtA、pRSFlpxA-thrA*BC-rhtA图谱。b野生型MG重组菌株细胞生长和L-苏氨酸产量的比较。cL-苏氨酸产生菌TWF重组菌株细胞生长和L-苏氨酸产量的比较
结论
本研究开发了一种新的大肠杆菌表达系统，即含有lpxA载体的lpxA缺失突变体。基因lpxA与基因lpxB、lpxD和fabZ位于相同的操纵子内。qPCR分析显示，lpxA缺失后，lpxD、fabZ、lpxB的转录水平没有发生变化，说明该缺失并不影响操纵子中其他基因的表达。由于染色体lpxA被完全删除，染色体中没有留下任何lpxA序列，lpxA不可能通过同源重组从载体回到染色体。考虑到lpxA对大肠杆菌的生长至关重要，其从染色体向表达载体的转移一方面不影响大肠杆菌的生长，另一方面，表达载体在大肠杆菌中不需要添加任何抗生素就可以维持。因此，本研究开发的lpxA移位表达系统不影响细菌生长，能稳定维持表达载体，在工业试验大肠杆菌等革兰氏阴性菌中具有高效表达基因的巨大潜力。
END
图片来源/来源文章
排版/关莹
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